在进行细菌涂片时应注意哪些环节：实操要点

在进行细菌涂片时应注意哪些环节，你要把控标本取材、载玻片预处理、涂片铺展、固定、染色、冲洗、镜前留存这一系列连贯操作，取材优先选取病灶新鲜分泌物，载玻片提前除油，菌膜薄而均匀，火焰固定温度不能过高，染色时长依照染料类型调整，水流缓速冲洗避免菌膜脱落，该整套操作适用于临床常规微生物涂片染色检测，不适用于需要活菌复苏培养的标本，活菌样本涂片后不可使用高温火焰固定。

细菌涂片的标本与玻片准备

标本取材尽量选取病变部位的新鲜材料，脓液、痰液优先挑取带脓丝、血性的部分，液体标本要充分混匀再取样，放置时间较长的标本杂菌数量会明显上升，容易干扰目标菌观察。载玻片选择无划痕的洁净玻片，你可以用脱脂棉蘸取无水乙醇擦拭表面油脂，晾干后再使用，玻片表面残留油污会造成菌膜聚拢、染色斑驳，直接降低镜检辨识度。标记信息使用铅笔在玻片磨砂面书写，墨水记号遇染色液容易溶解晕开，混淆标本编号。

标本量宁少勿多。

细菌涂片的涂布与固定操作

取接种环灼烧灭菌，冷却之后再蘸取标本，高温接种环直接接触样本会瞬间烫死菌体、破坏细菌形态，冷却判断可以在空中静置数秒，不要触碰无菌操作台以外物品。固体标本滴加一小滴无菌生理盐水，用接种环轻轻研磨打散，再向外匀速推开成一层薄菌膜，菌膜面积控制在玻片中间区域，厚度以对着光线看隐约透光为宜，菌体堆叠太厚，镜下会连成一片，无法分辨单独菌体形态。

固定分为火焰固定和化学固定，临床革兰染色大多采用火焰固定，手持玻片一端，菌膜朝上，快速穿过酒精灯外焰2到3次，手背贴近玻片背面感受温度，温热即可，玻片烫手说明温度超标，高温会让细菌细胞壁变形，菌体收缩、染色失真。对于脑膜炎奈瑟菌这类对热敏感的细菌，改用甲醇化学固定，减少菌体形态改变。

细菌涂片的染色、冲洗与收尾管控

脱色是整张涂片最容易出错的环节，脱色时间太短，阴性菌会保留紫色，造成假阳性，你要持续观察玻片流出来的液体颜色，颜色褪去马上用水终止脱色。冲洗全程水流保持平缓，水柱不能直接冲击菌膜位置，水流冲击力偏大，薄菌膜会整片脱落，标本直接报废。冲洗完成之后，竖立玻片自然沥干水分，不要用力擦拭菌膜区域。

干燥后的涂片优先及时镜检，不能长时间存放，空气中的灰尘、霉菌会落在菌膜表面形成杂质，干扰视野判断。暂时无法观察的涂片，放置在干燥避光的玻片盒内存放，存放时长建议不超过24小时，长时间放置部分细菌的染色特征会慢慢变淡，增加判读难度。

操作全程做好生物安全防护，涂片操作在生物安全柜内开展，产生的菌液废液、废弃接种环按照实验室生物废弃物规范处理，含有致病菌的涂片不能随意丢弃，避免气溶胶污染环境。

接种环每次使用前后都要充分灼烧灭菌，上一份标本的残留菌体，会带到下一张涂片，造成标本交叉污染，干扰最终镜检结果。